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1 范圍

本標準規定了進出口食品中厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌的檢驗方法。

本標準適用于進出口食品中厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌的檢驗。

2 定義

本標準采用下列定義：

厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌

群厭氧、過氧化氫酶陰性、能將亞硫酸鹽還原為硫化物的革蘭氏陽性梭狀芽胞桿菌。是食品、水、食品加工設備、食品生產環境等衛生狀況的評估指標菌之一。

3 設備和材料

3.1 均質器

3.2 恒溫水浴箱。

3.3 恒溫培養箱：36℃±1℃或46℃±1℃。

3.4 厭氧培養裝置。

3.5 菌落計數器。

3.6 吸管：1.0mL和10.0mL，分別具有0.1mL和1.0mL刻度。

3.7 培養皿：90mm或100mm。

3.8 低溫冰箱

3.9 顯微鏡。

4 培養基和試劑

4.1 氯化鈉胰蛋白胨稀釋液：見附錄A中A1。

4.2 亞硫酸鐵瓊脂：見附錄A中A2

4.3 庖肉培養基：見附錄A中A3。

4.4 3%過氧化氫溶液：使用前配制。

4.5 緩沖甘油-氯化鈉溶液：見附錄A中A4。

5 樣品制備

5.1 樣品的貯存和運送

冷凍樣品如不能立即進行檢驗，應置于-18C保存；非冷凍而易腐的食品，應加等量緩沖甘油-氯化鈉溶液(液體食品應加雙料)，置于4C冰箱保存。運送樣品時，應采取措施，防止樣品中微生物數量和性質發生變化。

5.2 制樣

將樣品解凍，取25g移入滅菌均質杯，加225mL氯化鈉胰蛋白胨稀釋液，以800r/min~10000r/min均質2min。如為液體樣品，則取樣25mL，加人盛有225mL氯化鈉胰蛋白胨稀釋液的500mL稀釋瓶中，搖勻。吸取此1：10樣品勻液10mL，加λ90mL.氯化鈉胰蛋白胨稀釋液中，充分混勻后根據樣品污染情況做進一步的系列十倍遞增稀釋。

若檢測厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞杄菌的芽胞，可對1：10樣品勻液進行75℃ 20min或煮沸保持l0min熱處理，之后以流水迅速冷卻至室溫后再做進一步的系列十倍遞增稀釋。

6 檢驗步驟與計數

6.1 平板計數法

適用于檢驗未經加工處理的生鮮食品及厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌>10/g(mL)的食品。

6.1.1 接種和培養

6.1.1.1 對每一份試樣，選用適宜的三個連續稀釋度的樣液，分別用滅菌吸管吸取1mL，一式雙份接種于每個滅菌的培養皿中。

6.1.1.2 傾注約15mL制備好的并于水浴箱保溫至50℃的亞硫酸鐵瓊脂。從制備*初稀釋液結束到傾注培養基于*后一個平皿所用的時間不應超過15min。仔細將接種物和培養基充分混勻，水平放置使其凝固。

6.1.1.3 待混合物凝固后，再傾注10mL 2%無菌瓊脂于已凝固的培養基上作為隔層。

6.1.1.4 待該隔層凝固后反轉制備好的平板于36℃±1℃厭氧培養24h~48h。若對培養溫度有特殊要求(如46℃)，可根據情況進行培養。

6.1.2 計數

6.1.2.1厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞杄菌在亞硫酸鐵瓊脂上呈黑色菌落。36C±1℃厭氧培養24h后，計數典型的菌落；若平板上無特征性菌落或菌落較小(<0.5mm)，則需繼續培養24h再計數；若48h后的菌落增大以至相連，則以24h的計數為準，反之則以48h為準。

那些僅產生氫〔而不是硫化氫(H2S)〕的厭氧菌生長時也可還原亞硫酸鹽而導致培養基出現彌散的、非典型的普遍變黑，這種現象不應計數。

6.1.2.2 從可計數的平板(具20~200個菌落)中任取10個典型菌落，分別取培養物按7.1和7.2進行證實試驗。對陽性結果進行計數。

6.1.2.3 平板典型菌落數乘以證實為厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌菌落所占比例，再乘以樣品稀釋倍數即為樣品中厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞杄菌的計數，報告為厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌/g(mL)。

6.2 *近似值(MPN)法

適用于檢驗含有受損傷的厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞杄菌的加工食品及厭氧亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌≤10/g(mL)的食品。

6.2.1 接種和培養

6.2.1.1 增菌

選用適宜的三個連續稀釋的樣液，從每個樣液中分別吸取1mL，一式三份接種于3管裝有庖肉培養基的試管中，36℃±1℃厭氧培養24h~72h。待出現生長特征(培養液混濁、產氣、出現異味)后，進行分離培養。反之，則按陰性計數。

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